注意!使用ecL化學發光液一定要明白這幾點

更新時間：2018-11-22

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ecL化學發光液的使用方法，執行常規SDS-PAGE、轉膜、洗膜。注意用HRP標記lgG或用一抗-鏈親和素-生物素-HRP夾法。推薦將一抗濃度稀釋到0.5ug/ml（0.05～1ug/ml均可）將二抗濃度稀釋到0.02ug/mL（0.005～0.04ug/mL均可）后1次洗膜的同時，新鮮配制發光工作液：根據用量將兩種組份按1:1比例混合均勻，備用。注：1）短時間暴露于日光燈下不會損害該工作液，但為獲得佳結果，將此工作液保存在棕色瓶中，避免暴露于任何強光。

取A液和B液一定要用不同的槍頭，工作液現配現用，室溫放置數小時后仍可使用但靈敏度略有降低。用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液，勿使膜*干燥。用移液器將工作液加到膜上（推薦150μl發光液/cm2膜），使之充分接觸。室溫孵育5分鐘，準備立即壓片曝光。用平頭鑷子夾起膜，膜的下緣輕輕接觸吸水紙，去除膜上多余的液體，留下少量工作液，不可讓膜*干燥。

在X光膠片暗盒內表面鋪一張面積大于膜的保鮮膜。將印跡膜貼在保鮮膜上，將保鮮膜折起來*包裹印跡膜，去除氣泡和皺褶，可剪去邊緣部多余的保鮮膜。用濾紙吸去多余的發光工作液。用膠帶將覆蓋印跡膜的保鮮膜固定在暗盒內，蛋白條帶面向上。在黑暗中將X感光膠片放置在包裹的保鮮膜上，根據蛋白濃度曝光適當時間（根據光強度需摸索曝光時間，一般30s-2min），顯影沖洗。注：根據經驗，如果背景過高，可使用兩張X感光膠片同時壓片。

ecL化學發光液的注意事項，步驟1～5可在日光燈下操作；但發光液曝露于強光下時間過久靈敏度可能略有降低，移到暗房操作可避免之。戴手套可以避免在膜上留下手印。長時間曝光或蛋白過量，將加深背景并使條帶強弱變化失去線性關系。曝光不足則條帶模糊。發光工作液孵育約3分鐘后膜上的條帶發光。強條帶發光在暗房中肉眼可見，低豐度蛋白條帶發光較弱甚至肉眼不可見但可使X光膠片曝光。不能簡單以肉眼觀察判斷條帶發光時間。肉眼不可見的熒光實際上可持續數小時并使X光膠片感光，因而弱帶可曝光1-10小時。如果曝光后條帶不佳，可用洗膜緩沖液洗膜，重新孵育二抗，然后重新用ECL發光和曝光。由于超敏發光液極其靈敏，強烈推薦大多數進口抗體起始濃度為一抗1:1000～1:4000，二抗1:2000～1:5000。抗體濃度過高將造成高背景或沒有條帶，導致失敗。某些保鮮膜包裹印跡膜時可能會淬滅熒光，應選擇高質量保鮮膜。使用肉眼可見的預染色蛋白Marker和熒光-放射自顯影曝光標簽可確定膠片上條帶的位置和大小。NaN3能抑制HRP活性，回收第二抗體應避免使用NaN3，如必需使用勿超過0.01%。