蛋白酶K溶液使用說明書

發布時間：2017/11/13

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蛋白酶K溶液（20mg/ml）

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蛋白酶K溶液（20mg/ml）

D1009L1162

2 mL

-20 ℃

120

產品簡介

蛋白酶K（Proteinase K），相對分子量約為29.3 kDa, 是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶。可切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵，應用廣泛，可用于制備脈沖電泳的染色體DNA，蛋白質印跡以及去除DNA和RNA制備中的核酸酶等實驗，蛋白酶K的一般工作濃度是50—100µg /ml。因蛋白酶K在變性劑如SDS（1%）中可提高其活性，所以在使用中，常根據所用緩沖液是否含有SDS、尿素、pH、溫度等因素確定具體的工作濃度。蛋白酶K在較廣的pH范圍內（pH 4-12.5）均有活性。

蛋白酶K有兩個Ca2+結合位點，它們離酶的活性中心有一定距離，與催化機理并無直接關系。然而，如果從該酶中除去Ca2+，由于出現遠程的結構變化，催化活性將喪失80%左右，但其剩余活性通常已足以降解在一般情況下污染核酸制品的蛋白質。所以，蛋白酶k消化過程中通常也加入EDTA（以抑制依賴于mg2+的核酸酶的作用）。但是，如果要消化對蛋白酶k具有較強耐性的蛋白，如角蛋白一類，則可能需要使用含有1mmol/l Ca2+而不含EDTA的緩沖液。在消化完畢后、純化核酸前要加入EGTA（ph8.0）至終濃度為2mmol/l，以鰲合Ca2+。

運輸和儲存

冰袋運輸，-20 ℃保存，可以保存12個月。避免反復凍融。

使用方法

1. 配制蛋白酶K溶液：一般以20mg/ml濃度配制蛋白酶K溶液。將200mg的蛋白酶K加入到9.5ml dd水中，輕輕搖動，直至蛋白酶K*溶解。不要渦旋混合。加水定容到10ml，然后分裝成小份貯存于-20℃。

2. 根據終濃度50—100µg /ml，吸取適量蛋白酶K溶液，到待消化樣品中，孵育溫度為55至65℃，理想孵育溫度為58℃，孵育時間為15分鐘至48小時;理想孵育時間為2小時。推薦反應緩沖液：50mM Tris-HCl (pH7.5),10mM CaCl2 。

注意事項

蛋白酶K在原位雜交技術中通常用于雜交前的樣品處理，它具有消化包圍靶DNA蛋白質的作用，能增加探針與靶核酸結合的機會，提高雜交信號。但蛋白酶K的濃度過高、消化時間過長或孵育溫度過高時，都會對細胞的結構有一定的破壞，導致組織切片的脫落，細胞核的消失，從而影響雜交結果。EDTA緩沖液可以替代蛋白酶K的作用，解決上述出現的問題，并能達到理想的染色效果。

常用蛋白酶作用位點

蛋白酶	分類	作用位點	已知抑制物
氨基肽酶	金屬蛋白酶	帶有自由氨基的L-氨基酸氨基末端；不能分解由X-Pro、D或Q組成的肽鍵	2,2-雙吡啶，1-(1)-菲咯啉
菠蘿蛋白酶	巰基蛋白酶	無特異性	α2巨球蛋白，TPCK，TLCK，烷化
羧肽酶A	鋅金屬蛋白酶	帶有自由氨基酸的L-氨基酸羧基端；不能分解R、P或羥脯氨酸	EDTA，EGTA
羧肽酶B	鋅金屬蛋白酶	K，R羧基端	EDTA，EGTA，堿性氨基酸
羧肽酶Y	絲氨酸羧肽酶	氨基酸羧基端	PMSF
組織蛋白酶C	琉基蛋白酶	氨基端雙肽，可通過K，R或P氨基端作為第二或第三個氨基酸封閉	醋酸碘，甲醛
胰凝乳蛋白酶	絲氨酸蛋白酶	在F，T或Y之后	抑肽酶，PMSF，TPCK，α—巨球蛋白
膠原酶	金屬蛋白酶	在P-X-G-P肽鏈中X之后	EDTA，EGTA，還原劑，但無血清存在
dispase	金屬蛋白酶	無特異性	EDTA，EGTA，Hg2+，重金屬
內肽酶Arg-C	絲氨酸蛋白酶	在R之后	α巨球蛋白，TLCK
內肽酶Asp-N	金屬蛋白酶	在D和半胱氨酸之前	EDTA，α菲咯啉
內肽酶Glu-C	絲氨酸蛋白酶	在E或D之后	α巨球蛋白，TLCK
內肽酶Lys-C	絲氨酸蛋白酶	在K之后	TLCK，抑肽酶，抑蛋白酶醛肽
腸激酶	絲氨酸蛋白酶	在D-D-D-D-K-肽鏈中K之后
Xa因子	絲氨酸蛋白酶	在R之后	PMSF，APMSF，大豆胰蛋白酶抑制物
無花果蛋白酶	琉基蛋白酶	無特異性	TPCK，TLCK，α-巨球蛋白
激肽釋放酶	絲氨酸蛋白酶	在一些R之后	抑肽酶，抑蛋白酶醛肽
木瓜蛋白酶	巰基蛋白酶	長期孵育時具有廣泛特異性	TPCK，TLCK，抑蛋白酶醛肽α—巨球蛋白，烷化劑
胃蛋白酶	酸蛋白酶	廣泛特異性	胃蛋白酶抑制素
纖溶酶	絲氨酸蛋白酶	在K或R之后	PMSF，TLCK，抑肽酶，α—巨球蛋白
鏈霉蛋白酶	混合型	無特異性	B．M．完整藥片
蛋白酶K	絲氨酸蛋白酶	廣泛特異性	PMSF，PefablocSc
枯草桿菌蛋白酶	絲氨酸蛋白酶	無特異性	PMSF，α巨球蛋白，苯甲脒
熱溶素	鋅金屬蛋白酶	在非極性殘基之前	EDTA
凝血酶	絲氨酸蛋白酶	在K之后	TLCK，PMSF，抑蛋白酶醛肽抑肽酶，α巨球蛋白，苯甲脒
胰蛋白酶	絲氨酸蛋白酶	在K或R之后	TLCK，PMSF，抑蛋白酶醛肽抑肽酶，α巨球蛋白

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