支原體快速檢測(cè)試劑盒（細(xì)胞培養(yǎng)）

更新時(shí)間：2017-12-14

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《Quick Cell快速支原體檢測(cè)試劑盒》主要用于檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清或別的液體樣品（如血清）中是否含有支原體污染，該試劑盒僅用于基礎(chǔ)科研。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)，支原體（Mycoplasma）污染是個(gè)世界性的問(wèn)題。支原體污染幾乎可以改變細(xì)胞的所有參數(shù)，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不準(zhǔn)確、甚至*錯(cuò)誤。從2013年開(kāi)始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及細(xì)胞培養(yǎng)都要進(jìn)行支原體檢測(cè)。本試劑盒可以檢測(cè)：（1）M.Hyorhinis、（2）M.Fermentans、（3）M.Arginini、（4）M. hominis、（5）M. orale、（6）M. salivarium、（7）M.pirum、（8）Acholeplasma Laidlawii、（9）M. agalactiae、（10）M.bovis、（11）M. buccale、（12）M. arthritidis、（13）M. pulmonis等幾乎所有常見(jiàn)的污染細(xì)胞的支原體（注：M.為Mycoplasma的縮寫(xiě)）。以上13種支原體約占細(xì)胞支原體污染的99%以上，本試劑盒產(chǎn)品全部可以檢測(cè)。絕大多數(shù)支原體污染集中于前8種。注意：本試劑盒無(wú)法檢測(cè)Ureaplasma Urealyticum支原體！Ureaplasma Urealyticum在支原體污染種極其罕見(jiàn)。

與PCR法檢測(cè)支原體比較，本試劑盒產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)優(yōu)勢(shì)顯著：

比較內(nèi)容	支原體檢測(cè)PCR法	Quick Cell 快速支原體檢測(cè)試劑盒
操作時(shí)間	3小時(shí)	1小時(shí)
是否需要樣品處理	樣品需預(yù)處理，DNA提取	無(wú)需樣品處理，直接使用上清
靈敏度	靈敏度低	較PCR法提高1000倍
是否需要電泳	需要電泳及染色	不需電泳，目測(cè)結(jié)果

試劑盒組成

（1）溶液Ⅰ：1150 μL （50次檢測(cè)）

（2）溶液Ⅱ：50 μL（50次檢測(cè)）

（3）溶液Ⅲ：指示劑，50 μL（50次檢測(cè)）

（4）陽(yáng)性支原體DNA：50 μL

（5）礦物油：1500 μL

使用方法

1. 待測(cè)樣品的準(zhǔn)備：為了準(zhǔn)確判斷細(xì)胞是否有支原體的污染，待測(cè)的細(xì)胞培養(yǎng)液樣品來(lái)源于至少培養(yǎng)三天且匯合度在70-90%左右的細(xì)胞培養(yǎng)上清（貼壁細(xì)胞），無(wú)需離心。懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞也需要在換液傳代后，至少讓細(xì)胞生長(zhǎng)3天再取培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)，也無(wú)需離心。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的存在不會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。

注：收集的待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液樣品如果不立即檢測(cè)，請(qǐng)放于-20℃或-80℃冰箱保存，不得放于室溫或4℃冰箱。樣品在-20℃至少可以保存一個(gè)月，在-80℃可以長(zhǎng)期保存。此外，為了節(jié)約檢測(cè)成本，可以將不同時(shí)間收集的樣品放于-20℃或-80℃冰箱保存，而后一起檢測(cè)。

2. 反應(yīng)體系的配制

表1：恒溫反應(yīng)體系的配制

組份	理論單個(gè)樣品用量	樣品總數(shù)	總體積
溶液Ⅰ	23 μL	N	23×N×1.08 μL
溶液Ⅱ	1 μL	N	1×N×1.08 μL
溶液Ⅲ	0.18 μL	N	0.18×N×1.08 μL

（1）將溶液Ⅰ、溶液Ⅲ從-20℃冰箱中取出，待其融化后（可在37 ℃ 水浴內(nèi)放置5-10分鐘以幫助融化），從-20℃冰箱中取出溶液Ⅱ置于冰上。吹吸均勻后，按表1比例，混合溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ。如有多個(gè)樣品，為了防止移液誤差，建議溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ用量乘以系數(shù)1.08，保證每個(gè)反應(yīng)管中的反應(yīng)液足量。從配液開(kāi)始的所有步驟，均在冰上操作。

舉例：如果待測(cè)樣品為3個(gè)（加上1個(gè)陰性和1個(gè)陽(yáng)性對(duì)照），則樣品總數(shù)為5個(gè)。溶液Ⅰ的總體積為23×5×1.08=124.2μL，溶液Ⅱ的總體積為1×5×1.08=5.4μL，溶液Ⅲ的總體積為0.18×5×1.08=0.972 μL將溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ混合均勻。

注：溶液Ⅱ必須一直在-20 ℃冰箱中保存，并在操作時(shí)置于冰上。溶液Ⅱ即使在-20 ℃條件下仍為液態(tài)，不需置于室溫。

（2）將上述配制好的反應(yīng)體系，吹打均勻后，按每管24 μL分裝到0.2 mL的PCR管中。盡量保證每管的反應(yīng)液體積一樣。 PCR管應(yīng)該使用透明度良好的薄壁PCR管。

（3）往測(cè)試管（Test）中加入1μL待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液；往陽(yáng)性對(duì)照管（Positive）中加入1 μL陽(yáng)性支原體DNA；往陰性對(duì)照管（Negative）中加入1μL滅菌水；反應(yīng)液的總體積為25 μL。

注1：裝有陽(yáng)性支原體DNA的螺口管開(kāi)蓋之前，用力甩一下，或者用迷你離心機(jī)即可。

注2：進(jìn)行反應(yīng)體系配制的房間，與進(jìn)行樣品前處理、加陽(yáng)性對(duì)照DNA、樣品DNA的房間分開(kāi)。

3. 反應(yīng)

PCR儀設(shè)置程序：61℃，60 min；10℃, forever；熱蓋溫度，100 ℃。

注意：若實(shí)驗(yàn)室反應(yīng)場(chǎng)所沒(méi)有PCR儀，可用水浴鍋代替，水浴鍋顯示溫度與實(shí)際溫度的溫差不超過(guò)0.5℃，另須往每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)加入25μL礦物油，以防止水份揮發(fā)，然后蓋上蓋子，將反應(yīng)管插入帶孔的漂板內(nèi)，放入已經(jīng)升溫到61℃的水浴內(nèi)，準(zhǔn)確反應(yīng)60分鐘。

4. 結(jié)果判斷

61℃反應(yīng)60分鐘后，立刻取出反應(yīng)管，放于室溫。以一張白紙或白色泡沫盒為背景，通過(guò)反應(yīng)管溶液顏色的變化，即可判斷檢測(cè)結(jié)果。如果溶液為藍(lán)綠色，則說(shuō)明有支原體污染；如果為紫紅色，則說(shuō)明沒(méi)有支原體污染（如圖1）。

注：在61℃反應(yīng)的時(shí)間必須準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，zui多不得超過(guò)5分鐘，以免出現(xiàn)假陽(yáng)性。必須在反應(yīng)后2小時(shí)內(nèi)進(jìn)行結(jié)果判斷，避免室溫下擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行，影響結(jié)果判別。